Secuenciación Sanger del virus de la Hepatitis B

En este método, una ADN polimerasa sintetiza las cadenas complementarias de una de las hebras del ADN problema, en cuatro reacciones enzimáticas distintas

Objetivo: 

• Secuenciar el genoma del VHB
• Detección de genomas de VHB resistentes al tratamiento (genomas del A al F)

Tipo de muestra biológica: Suero del paciente

Ácido nucleico: todo el genoma viral (ADN)

Procedimiento:

En cada reacción, junto con el oligonucleótido utilizado como cebador de la reacción de polimerización y la mezcla de los cuatro nucleótidos (dATP+dCTP+dGTP+dTTP), que al carecer de radical hidroxilo en la posición 3´, no permitirá la incorporación de otro  nucleótido a continuación impidiendo la extensión de la cadena de ADN.

El marcaje (isotópico o fluorescente) del fragmento generado puede realizarse partiendo de cebadores previamente marcados en su extremo 5´, o bien empleando ddNTP marcados que, además de detener la síntesis de la cadena, introducirán la señal que permita detectarla

Resultados:

Se obtiene la siguiente prevalencia de genotipos: 26/40(65%) genotipo D, 10/40(25%) genotipo A, 3/40(7,5%) genotipo F, 1/40(2,5%) genotipo G

Visualización:

Análisis de las secuencias mediante el programa PHYLIP y OMIGA2.0

Bibliografía

https://eprints.ucm.es/id/eprint/4720/1/T26838.pdf