ADN Recombinante natural y artificial en la infección por Helicobacter pylori

ADN Recombinante artificial

Tema: Producir un vector recombinante pcDNA3.1 (+) - ureA

Objetivos:

·        Evaluar la capacidad de este vector para estimular la respuesta inmune contra la infección por H. pylori en ratones BALB / c infundidos.

Gen a clonar: gen ureA

Enzima de restricción: XbaI y XhoI

Enzima ligasa: no especifica

Vector: plásmido pcDNA3.1

Célula receptora: E. coli Top10F

Método de inserción del gen: Transformación

Método de identificación de clones: PCR convencional

Resultados: Este vector si mejoró la respuesta inmune por lo que en estudios futuros, esta construcción recombinante se puede utilizar como biomarcador y enfoques terapéuticos en sistemas eucariotas.

ADN recombinante en la naturaleza

El ADN recombinante en las bacterias puede observarse por ejemplo cuando la bacteria capta ADN libre. En ese caso, la Helicobacter pylori tiene a los T4SS que median la captación de ADN libre, esto media la transformación en los patrones de expresión génica y la fisiología bacteriana.

Bibliografía

https://uceedu-my.sharepoint.com/:b:/g/personal/gncarlosamad_uce_edu_ec/ET9dWkWV1IZItUZdLgyGB_YBnAclGk_UytguxNZXQPgEgw?e=srbQja

https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-3-319-75241-9_3

Secuenciación Sanger del virus de la Hepatitis B

En este método, una ADN polimerasa sintetiza las cadenas complementarias de una de las hebras del ADN problema, en cuatro reacciones enzimáticas distintas

Objetivo: 

• Secuenciar el genoma del VHB
• Detección de genomas de VHB resistentes al tratamiento (genomas del A al F)

Tipo de muestra biológica: Suero del paciente

Ácido nucleico: todo el genoma viral (ADN)

Procedimiento:

En cada reacción, junto con el oligonucleótido utilizado como cebador de la reacción de polimerización y la mezcla de los cuatro nucleótidos (dATP+dCTP+dGTP+dTTP), que al carecer de radical hidroxilo en la posición 3´, no permitirá la incorporación de otro  nucleótido a continuación impidiendo la extensión de la cadena de ADN.

El marcaje (isotópico o fluorescente) del fragmento generado puede realizarse partiendo de cebadores previamente marcados en su extremo 5´, o bien empleando ddNTP marcados que, además de detener la síntesis de la cadena, introducirán la señal que permita detectarla

Resultados:

Se obtiene la siguiente prevalencia de genotipos: 26/40(65%) genotipo D, 10/40(25%) genotipo A, 3/40(7,5%) genotipo F, 1/40(2,5%) genotipo G

Visualización:

Análisis de las secuencias mediante el programa PHYLIP y OMIGA2.0

Bibliografía

https://eprints.ucm.es/id/eprint/4720/1/T26838.pdf

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en el VHB

 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una prueba de certeza que amplifica secuencias de ADN de interés mediante el uso de cebadores. En el caso del VHB, se sugiere el uso de PCR en tiempo real (qPCR).

Objetivo: 

• Identificación de infección por VHB
• Cuantificar el genoma del VHB

Tipo de muestra biológica: 

• Suero del paciente
• Lisado celular
• Sobrenadante de cultivo celular

Tipo de ácido nucleico extraído: ADN viral

Kit: kit QIAamp DNA Mini (Qiagen, Hilden, Alemania) para las células, mientras que se utilizó un kit QIAamp MinElute Virus Spin (Qiagen) para los sobrenadantes libres de células.

Gen o secuencia a amplificar: Genoma entero

Polimerasa usada: Hi Fidelity y cebadores con sitios de restricción para la enzima BspQi

Tipo de PCR: PCR en tiempo real (qPCR)

Ciclos: 60-70

Bibliografía

https://ri.conicet.gov.ar/bitstream/handle/11336/83120/CONICET_Digital_Nro.b2c88add-92b0-4979-84bf-ce747e826da2_A.pdf?sequence=2&isAllowed=y

Alteraciones de la Epigenómica en la Hepatitis B

La epigenética se encarga en general de silenciar o activar genes, mediante la metilación de ADN y acetilación de histonas, lo cual, modifica la estructura de la cromatina del hospedador. Un tema de interés para la investigación en epigenética es la detección de posibles patrones de metilación de genes en diferentes patologías y estadíos de las mismas.

En el caso del VHB, se lo relaciona con el carcinoma hepatocelular, ya que los mecanismos intrínsecos de las células contribuyen a la hepatocarcinogénesis mediada por el virus de la hepatitis B. Estos incluyen:

• 1.       Interacción de las proteínas HBsAg con el RE, causando mutaciones por la generación de radicales libres
• 2.       Integración del genoma del VHB en el genoma del huésped induciendo deleciones de ADN, o por inserción en la proximidad de genes relevantes para el cáncer
• 3.       Activación de las cascadas de señalización mitogénica celular por la proteína viral HBx esencial

Bibliografía

https://www.researchgate.net/profile/B-Coello/publication/316215116_Avances_en_el_Estudio_Experimental_de_la_Bioquimica_Hepatica/links/58f638b7aca27295fa2e5f57/Avances-en-el-Estudio-Experimental-de-la-Bioquimica-Hepatica.pdf#page=165

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7894648/